IVIM-PM2.5在呼吸系統(tǒng)中的暴露誘導不同的 肺部和小鼠肝臟的炎癥信號

• 2021年8月17日 YangJinZhu來源：互聯(lián)網(wǎng) 976 61
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呼吸系統(tǒng)暴露在PM2.5中會誘導出小鼠肺和肝臟不同的炎癥信號

　　細顆粒物質(zhì)2.5（PM2.5）是目前威脅公共衛(wèi)生的有害空氣污染物。雖然已經(jīng)對小鼠和人類的PM2.5的一般負面影響進行了許多研究，但各種免疫細胞的遷移模式響應(yīng)PM2.5暴露仍然尚不清楚。在這項研究中，我們旨在探討肺部的免疫細胞遷移反應(yīng)和腹腔內(nèi)PM2.5接種小鼠的肝臟。為了研究肺部免疫細胞和小鼠肝組織中的免疫細胞遷移軌跡，我們使用微觀工具，包括雙光子倒注成像，組織學分析和透射電子顯微鏡。

　　我們來自兩光膜內(nèi)腔內(nèi)成像的數(shù)據(jù)表明，與非處理的條件相比，肺部肺和PM2.5處理小鼠的肝臟滲透中性粒細胞的數(shù)量沒有顯著差異。然而，從組織學分析和透射電子顯微鏡從血管灌注后去除血管內(nèi)白細胞，我們觀察到在肺部和PM2.5處理的小鼠的肺部經(jīng)常觀察到一些白細胞。有趣的是，使用流式細胞術(shù)的白細胞群定量顯示出肺中的中性粒細胞和巨噬細胞的顯著增加，但在PM2.5后24小時的肝臟中沒有太多。

　　這些數(shù)據(jù)意味著肺和肝臟的雙光子倒注成像實際上可視化中性粒細胞，其粘附在脈管系統(tǒng)的腔側(cè)。然后我們進行mRNA微陣列分析以進一步觀察PM2.5如何影響肺部和肝臟中的基因表達模式。PM2.5治療改變了與肺中IL-17信號傳導途徑相關(guān)的mRNA表達，并改變了與肝臟中代謝途徑相關(guān)的mRNA表達?？傊@些結(jié)果表明肺部的免疫應(yīng)答在急性PM2.5誘導的炎癥下的肝臟中的顯著調(diào)節(jié)，因此這些器官通過不同的信號通路調(diào)節(jié)。

　　Introduction

　　近年來，顆粒物 (PM2.5) 因其生物危害效應(yīng)而成為世界范圍內(nèi)各種人工污染物中的關(guān)注焦點。與自然產(chǎn)生的“灰塵”不同，PM 主要由柴油燃燒、建筑工廠和發(fā)電廠排放的化學物質(zhì)組成[1]。PM根據(jù)大小可分為兩組：PM10和PM2.5。PM10 是指直徑小于 10 μm 的顆粒物，而 PM2.5 是指直徑小于 2.5 μm 的顆粒物。雖然 PM 的成分因來源而異，如重金屬和酸性物質(zhì)，但主要由黑碳組成。PM可以吸入氣管和肺部，因為它極小且易于沉積到肺泡甚至是血液中，會導致炎癥反應(yīng)。因此，這種炎癥可能不僅是導致呼吸系統(tǒng)障礙的原因，也可能引發(fā)各種器官的永久性損害。暴露于PM2.5中也會導致生殖能力變差[2]和或腦功能損傷[3]。

　　肺是管理血液中氧氣和二氧化碳交換的重要器官。由于肺部與空氣直接接觸，這個器官不可避免地面對許多病原體，從灰塵到病毒。當氣管和肺組織暴露于人造污染物時，白細胞分泌細胞因子和趨化因子，導致急性炎癥[4]，PM可以誘導并加強這些信號分子的分泌。因此，PM 會影響肺部通路并加重慢性阻塞性肺病[5,6]、肺炎 [7] 和哮喘[8]等疾病。關(guān)于PM2.5對肺部的影響已經(jīng)研究了幾十年，但對肝臟影響的研究報告是相當罕見的。肝臟在身體中有解毒功能并凈化血液[9,10]。然而，因為肝臟被稱為沉默器官，當個體暴露于PM2.5時，難以檢測炎癥的癥狀。然而，由于肝臟被稱為“沉默的器官”，當個體暴露于 PM2.5環(huán)境中，很難發(fā)現(xiàn)炎癥癥狀。在這里，我們檢查了PM暴露小鼠模型中 PM2.5 是否通過引起炎癥來影響肺和肝臟。此外，還進行了微陣列分析以研究肺和肝臟的信號通路。

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　　圖 1：暴露于顆粒物 2.5 的小鼠肺和肝臟中性粒細胞的雙光子活體成像。(a) 圖片展示 超聲處理前后 PM2.5 的差異。比例尺，10μm。用 PM2.5 處理 LysM-GFP 小鼠， 分別通過小鼠肺 (b) 和肝臟 (c) 的雙光子活體成像在治療后 24 小時和 48 小時記錄中性粒細胞。看 視頻 1、2、3 和 4。血管被葡聚糖-德克薩斯紅染色。比例尺，50μm。10 分鐘時的中性粒細胞數(shù)為 分別從小鼠肺（d）和肝臟（e）的雙光子成像計數(shù)。中性粒細胞沒有明顯增加 與對照組相比，肺和肝組織中的數(shù)量。

　　Discussion

　　由于PM2.5粒徑極小，幾乎可以通過血液到達身體的所有器官[22]。據(jù)報道，空氣中高濃度的 PM2.5 會導致心臟和呼吸系統(tǒng)疾病的增加 [12]。肺是可以通過氣管直接吸入PM2.5的器官，而肝臟不與PM2.5直接接觸。選擇肝臟作為比較器官來研究吸入的 PM2.5 對肺的影響，因為它在損傷的早期階段起到解毒的作用，并且無癥狀[13]。我們對這兩個器官的比較研究表明，通過呼吸道引入的PM2.5可通過血液暴露在呼吸系統(tǒng)以外的二級器官中引起炎癥。使用雙光子顯微鏡，每個器官的特定結(jié)構(gòu)，包括肺（肺泡和毛細血管）和肝臟的內(nèi)部解剖結(jié)構(gòu)，以及小鼠模型中中性粒細胞的形態(tài)，都以延時方式成功監(jiān)測。這是一種將活體動物的肺或肝臟外化以進行活體成像的侵入性手術(shù)。手術(shù)過程可能會引起外化器官組織的炎癥環(huán)境。因此，最大限度地減少器官組織中的自主炎癥狀況非常重要。

　　為了研究施加PM2.5對小鼠的炎癥作用，我們在嚴格控制的條件下以最小的自主炎癥進行手術(shù)。我們還使用H&E染色進行了組織學分析，并使用TEM和流式細胞術(shù)進行了超微結(jié)構(gòu)分析。在H&E染色和TEM成像中，我們能夠觀察到經(jīng)過PM2.5處理后的肺和肝組織中的白細胞。流式細胞術(shù)數(shù)據(jù)顯示，PM2.5處理后48小時內(nèi)，肺中中性粒細胞顯著增加。盡管該結(jié)果與檢測組織和血管中免疫細胞的雙光子活體成像數(shù)據(jù)不一致，但這仍然表明浸潤到組織的中性粒細胞有所增加。

　　IL-17 通路的表達在微陣列，特別是肺組織的富集圖中發(fā)生了變化，PM2.5 處理后 48小時IL-17 表達的變化比處理24小時的更顯著。當肺受損時，肺先天淋巴細胞 (ILC) 會迅速產(chǎn)生 IL-17，這可以解釋我們的結(jié)果，因為ILC對增強早期免疫病理學有很大貢獻 [14]。PM2.5處理后肝臟代謝相關(guān)通路的表達發(fā)生變化；更具體地說，觀察到與代謝相關(guān)的肝功能增強[15]。由于肝臟有 500 多種不同的作用和功能，因此無法辨別 PM2.5直接影響哪種機制。與免疫系統(tǒng)直接相關(guān)的反應(yīng)途徑?jīng)]有發(fā)生顯著變化。

　　然而，在GSEA中，我們可以發(fā)現(xiàn)與免疫反應(yīng)有關(guān)的CCL5 基因表達增加。我們的數(shù)據(jù)顯示中性粒細胞數(shù)量沒有顯著變化，盡管已知這些先天免疫細胞會滲透到炎癥組織中。這可能是因為我們在本實驗中使用的PM2.5與實際大氣條件下的PM2.5不同。大氣中的PM2.5主要由碳骨架組成，另外還混有SO42- 、NO 3- 、NH 4 + 離子、有機物、地殼物質(zhì)等多種物質(zhì)[27]。然而，我們實驗中使用的PM2.5完全由具有簡單碳骨架的柴油顆粒材料組成。大多數(shù) PM2.5 研究側(cè)重于通過長期吸入引起的慢性疾病 [28-31]。在這里，我們對經(jīng)過PM2.5處理后48小時內(nèi)的急性炎癥反應(yīng)進行了實驗，這可能很難誘導中性粒細胞滲透。然而，據(jù)我們所知，這項研究將是第一次嘗試使用活體成像研究每個免疫細胞群的遷移模式，并驗證PM2.5處理過的小鼠肺和肝臟中不同的炎癥信號通路。通過微陣列數(shù)據(jù)識別肺和肝組織中的不同通路，表明不同的治療方法可能適用于患有與PM2.5相關(guān)的疾病的患者，具體取決于他們的癥狀。對PM2.5長期暴露的進一步研究也可能提供與長期炎癥相關(guān)的各種通路的信息。

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　　圖 4：PM2.5 處理后肺和肝臟 mRNA 表達模式的比較。(a, b) 分別比較肺和肝臟的 PM2.5 治療組和對照組的微陣列簇圖像。(c, d) 顯示了每個器官在 PM2.5 處理后 mRNA 表達增加的 20 個最重要的京都百科全書基因和基因組 (KEGG) 途徑。紅框顯示了與免疫系統(tǒng)、細胞因子和人類疾病相關(guān)的通路。(e, f) 顯示了 IFN-γ 反應(yīng)途徑的 GSEA 結(jié)果；PM2.5 處理后 48 小時評估的小鼠肺和肝臟中的共同通路顯著增加，NES 分別為 1.792 和 1.434。（g）CCL5基因表達的定量實時PCR分析（2ΔΔCt法）顯示在對照組和肺和肝臟的PM2.5后48小時治療組。數(shù)據(jù)表示為平均 SEM (n = 5)。

　　該實驗圖像（1）由ivim小動物活體原位細胞動態(tài)分析成像系統(tǒng)完成成像

　　（產(chǎn)品資料請參考下文）

　　小動物活體成像系統(tǒng)

　　活體成像技術(shù)主要是利用一套非常靈敏的光學檢測儀器，能夠直接監(jiān)控活體生物體內(nèi)的細胞活動和基因行為。通過這個系統(tǒng)，可以觀測活體動物體內(nèi)腫瘤的生長及轉(zhuǎn)移，感染性疾病發(fā)展過程、特定基因的表達等生物學過程。其優(yōu)點為較傳統(tǒng)屠宰動物相比，該技術(shù)能夠?qū)ν环N實驗對象在不同時間點進行記錄，跟蹤同一觀察目標（標記細胞及基因）的移動及變化，所得的數(shù)據(jù)更加真實可信。目前主要采用生物發(fā)光（bioluminescence）與熒光（fluorescence）兩種技術(shù)。IVM-CM是韓國IVIM Technology公司全新推出應(yīng)用于小動物活體原位動態(tài)成像系統(tǒng)，能夠?qū)崿F(xiàn)動態(tài)實時成像活體內(nèi)各種細胞水平的動態(tài)變化，如：上升運動、細胞一細胞／細胞微環(huán)境相互作用和對刺激的各種生理反應(yīng)，體內(nèi)成像：肝臟，淋巴結(jié)，脾臟，皮膚，視網(wǎng)膜，肺，腦，結(jié)腸，胰腺，小腸，前列腺，腎臟，心臟，氣管，食道，食道，骨髓，胸腺等。

　　VM-CM 技術(shù)特點：

　　√ 雙光子激光器波長范圍：690nm-1050nm

　　√ 視野范圍（FOV）：100*100um2-10*10mm2

　　√ 成像像素：100fps@512*512pixels

　　√成像深度：1000um

　　√體內(nèi)成像種類：肝臟，淋巴結(jié)，脾臟，皮膚，視網(wǎng)膜，肺，腦，結(jié)腸，胰腺，小腸，前列腺，腎臟，心臟，氣管，食道，食道，骨髓，胸腺等。

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　　目前該產(chǎn)品IVM-CM正在和國內(nèi)知名的WAD集團，上海埃飛電子科技有限公司合作，為國內(nèi)科研機構(gòu)提供快速有效的活體成像解決方案。

　　技術(shù)原理：

　　應(yīng)用領(lǐng)域：

　　免疫學研究

　　癌癥研究

　　靶向研究

　　分子病理學

　　應(yīng)用案例：

　　對心肌梗死的小鼠心臟中免疫細胞的延時成象的新方法：

　　IVM-CM通過特定的窺鏡結(jié)合一個通過肋間間隙的小切口來顯示心臟組織中熒光標記的細胞和血管。提出了一個微型吸引輔助內(nèi)窺鏡適合成像細胞事件在跳動的心臟的老鼠。內(nèi)窺鏡使用了一個吸引管裝置，可以局部穩(wěn)定下面的組織而不造成有害影響，并允許細胞水平成像。內(nèi)窺鏡可以通過在皮膚和肋骨間的肌間做一個小切口進入心臟的外表面而不折斷骨頭。

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